原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法

原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法

原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也最接近和反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類型(上皮樣或成纖維樣)，但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個體差異也照樣存在，原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴(yán)格的對比性實(shí)驗(yàn)研究，還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。

1、組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法:為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁,使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長，方法簡便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時后細(xì)胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到的生長暈，5～7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究。其培養(yǎng)方法如下:

(1)按照前述方法取材,將組織剪成或切成1mm³大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。

(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2cm～0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm²)可接種20～30小塊為宜，小塊放置后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。

(3)培養(yǎng)24小時，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴(yán)禁搖動和來回振蕩,以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動和觀察時要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3～5天時可換液，一方面補(bǔ)充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。

2.消化培養(yǎng)法

該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)(包括基質(zhì)、纖維等)去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。某些特殊類型細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。

3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法

對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離,直接培養(yǎng),或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

4.器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對器官組織的生長變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細(xì)胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。

1. 器官培養(yǎng)的特殊的要求

(1)需要特殊的培養(yǎng)條件因器官離體培養(yǎng) ,其營養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來供給，因此，培養(yǎng)時為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過1mm。

(2)器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入常采用以下兩種方法:

①將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時仍需保持5%C02，以維持pH。

2. 器官培養(yǎng)的方法

(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為1/2 皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。

(2)將培養(yǎng)基加入平皿中,使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜,但不要使濾膜浮起。

(3)將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，-般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm²，如為肝、腎不能大于1mm²。

(4)將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達(dá)90%，培養(yǎng)時注意使液面與膜保持在一致的水平上。

(5)上述器官培養(yǎng)1～3周(每隔2～3天換液一次)后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持

(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)

1、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))

凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來源的細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性,細(xì)胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×10⁸細(xì)胞/L，培養(yǎng)基可用Eagle (MEM)或DMEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%~80%，有條件的應(yīng)在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在起始的2天中盡量減少振蕩,以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。若原代貼壁細(xì)胞不是用于長期培養(yǎng)，只是用于分離繁殖或測定病毒之用，其細(xì)胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價提高和測定結(jié)果(如空斑)更加明顯、準(zhǔn)確，待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀,此時的pH若有明顯變化,應(yīng)將原代細(xì)胞換液，即倒去舊液,換入新鮮的培養(yǎng)基,以便除去衰老、死亡的細(xì)胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細(xì)胞能獲得充足的營養(yǎng)。若用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞開始貼壁生長,為了利于該貼壁細(xì)胞充分貼壁和生長，此時換液應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細(xì)胞懸液放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次換液后,貼壁肌樣細(xì)胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時換液可將原懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基移入另一新瓶，然后分別補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基(也按半量換液方式分別對半加入新液)繼續(xù)培養(yǎng)，原瓶的貼壁細(xì)胞逐漸長成單層，而新瓶中又會出現(xiàn)二次貼壁細(xì)胞，經(jīng)幾次換液也會逐漸長成單層,在此類細(xì)胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中往往需加入少量的維生素D3、 bFGF、地塞米松、小牛血清(濃度要在20%以上)，以利細(xì)胞貼壁生長。

2、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)

凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞,在原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細(xì)胞。若作用于試驗(yàn)的短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞濃度可在5～8×10⁹/L范圍內(nèi)，然后進(jìn)行分瓶試驗(yàn)。若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)行長期培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子,白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長，待細(xì)胞開始增殖甚至結(jié)成小團(tuán)塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說明細(xì)胞生長繁殖良好，-般每隔3天需半量換液一次(換液時盡量使細(xì)胞不丟失) ,待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時，此時可考慮傳代。但千萬不能急于傳代，一定要待細(xì)胞密度較高時才能進(jìn)行，以防傳代失敗。

(二)原代細(xì)胞的維持

1、貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的換液)

貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH 變酸，不適宜細(xì)胞生長，此時細(xì)胞還未長成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)基。若希望細(xì)胞能在較長時間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。

2、懸浮細(xì)胞

凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細(xì)胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源(PHA、PMA、COnA、PVM、LPS等)后，細(xì)胞不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細(xì)胞不適宜生長，需進(jìn)行換液。白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞體外長期培養(yǎng)時，都需換液培養(yǎng)，待達(dá)到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。半量換液的方法如下:將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi),若細(xì)胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半， 上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基。若細(xì)胞不能沉于瓶底，可吸出細(xì)胞懸液，采用低速離心( 1000r/min 10min)棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

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